-1-
СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ О ГЕПАРИНЕ И
ЕГО БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Гепарин - чрезвычайно важное соединение , синтезируемое в организме
животных и человека . Это биологически активное вещество , антикоагулянт
широкого спектра действия , регулятор многих биохимических и
физиологических процессов , протекающих в животном организме , в настоящее
время приковывает к себе пристальное внимание биологов , физиологов ,
фармакологов и клиницистов . Весьма эффективное использование гепарина в
клинической практике выдвигает этот препарат в число перспективных
фармакологических агентов .
ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ГЕПАРИНА
В исследованиях структуры гепарина большое значение имеет изучение типа
гликозидной связи , определение содержания серы и сульфамидных
карбоксиль- ных и других групп , количества ветвей в молекуле , а также
выяснение природы уроновокислого компонента и т.д. Изучение
молекулярной структуры гепарина очень важно , во-первых , с точки
зрения сопоставления химической структуры этого вещества и его
антикоагулянтных и других физиологических свойств , например , таких,
как способность образовывать комплексы со многими веществами. Здесь
можно указать на большую роль комплексных соединений гепарина с рядом
тромбогенных белков плазмы крови и некоторыми биогенными аминами в
регуляции жидкого состояния крови . Во-вторых , детальное выяснение
структуры гепарина открывает определенные перспективы на пути
исскуственного синтеза этогонезаменимого медикамента . По химическому
строению гепарин представляет собой высокосульфированный мукополи-
сахарид , состоящий из последовательно чередующихся остатков -D-
- глюкороновой кислоты и 2-амино-2-дезокси - - D - глюкозы , соединенных
связями 1—4 . Основная связь в гепарине — это 1—6 гекзоамин . Вольфром и
соавторы (Wolfrom et al.,1966) обнаружили , что конфигурация 2-амино-2-
дезокси--D - глюкороновокислотной связи представляет собой -D-связь.
Наряду с этим отмечается существование и некоторой - конфигурации. В
молекуле гепарина на тетрасахаратную единицу приходится по 5—6, 5
сульфатных групп . Остатки серной кислоты присоединены к ОН-группам
глюкозамина . Высокое содержание сульфогрупп обусловливает значительный
от рицательный заряд и , следовательно , большую подвижность в
электрическом поле . Около 10% аминогрупп гепарина находится в свободном
состоянии . Большинство же из них сульфатированны.
Сульфокислотные группы, вероятно, присоединены к аминогруппам с обра-
зованием аминосульфокислоты.
Молекулу гепарина принято рассматривать как протяженную, неразветв-
леннуюлинейную структуру. Так, электронно-микроскопические исследования
показали, что длина молекулы гепарина равна 160=40 А . Наряду с этим
некоторые авторы высказываются в пользу разветвленной структуры.
По данным Вольфрома и Вэнга, гидроксильная группа с-6 2-амино-2-
де-
зокси-D-глюкозной единицы гепарина сульфатированы. Видимо, в указанной
выше единице гепарина существуют две сульфатные группы.
Причем остаток D-глюкуроновой кислоты не сультирован. Денишефски и
соавторы считают, что в гепарине сульфатировано по атому углерода
в
положении 2 1/3 глюкуроновокислотного компонента и большая часть
глю-
козаминов сульфатирована по атому углерода в положении 6.
До сих пор окончательно не решен вопрос о том,содержит ли
гепарин
ацетильные группы. В то же время при исследовании бычьего, свиного
и
китового гепарина установлено, что химическое строение и
распреднление
остатков N-ацетилглюкозамина одинаково во всех препаратах.
Изучение структуры гепарина методом ЯМР показало,что гексуроновые
остатки находятся в молекуле в конформации С-1.
В содержании и составе гексуроновых кислот в гепаринах и
гепарино-
вых фракциях различных млекопитающих обнаружены значительные раз-
личия. D-глюкуроновая кислота - основная уроновая кислота, входящая в
состав гепарина. В гепарине также отмечено наличие кетуроновой и L-
идуроновой кислот и найдено, что их соотношение равно 2,6 1. Для
ге-
парина характерно присутствие относительно большого количества ( до
1/3) L- идопираносилуровых остатков. Определение уровня уроновых кис-
лот ( идуроновой и D- глюкуроновой), входящих в различные гепарины и
гепарансульфаты, показало, что содержание идуроновой кислоты не
зависит от источника гепарина или гепарансульфатов и составляет
соот-
ветственно 50-90 и 30-55 %. В исследуемых мукополисахаридах
увеличивалась величина соотношения N- к О- сульфатам по мере
возрастания в них уровня идуроновой кислоты. Величины отношений N-
сульфата к глюкозамину в гепарине и гепарансульфатах составляют 0,7-
1,0 и 0,3- 0,6. Отношение S- сульфата к глюкозамину изменяется в
пределах 0,9- 1,5 для гепарина и 0,2- 0,8 для гепарансульфата.
Видимо, это свидетельствует в пользу того, что гепарансульфаты
представляют собой предшественники гепарина при его биосинтезе.
Изучение продуктов деградации гепарина под действием ферментов,
выделяемых из среды бактерий Flavobacterium heparinum, позволило сде-
лать вывод, что его молекула состоит из ряда последовательно распо-
ложенных стуктурных элементов, которые могут быть представлены как
1 - 4 связанные биозные остатки 2- сульфата 4-О-( (- L-
идопираносульфу-
роновой кислоты) и 2-( дезокси- 2 - сульфамино-(-D- глюкопираносил-6-
сульфата). Повторяющиеся тетрасахаридные единицы, включающие в себя
два уроновых и идуроновых остатка,-такова структура молекулы ге-
парина по представлениям Хелтинг и Линдал.
Данные о способе связей между повторяющимися единицами гепарина
весьма разноречивы. По ширине рентгеновских отражений установлено,
что молекула гепарина содержит 10 тетрасахаридных поаторяющихся еди-
ниц.
При выделении гепарина из печени быка были получены три
фракции, две из которых гомогенны. Биологическая активность этих
фракций росла пропорционально молекулярному весу. Так, максимальная
активность бы-
ла у фракции с молекулярным весом 16200, а минимальная - у фракции
7600. Установлено, что во фракциях с молекулярными весами 16200 и
15500 белковых примесей больше, чем во фракции 7600. Во всех фрак-
циях был обнаружен глюкозамин, галактозамин, гексуронат, сульфат, га-
лактоза и ксилоза в разных количествах. Некоторые незначительные
отличия,наблюдаемые в структуре гепарина , видимо объясняются тем , что
исследуемые препараты получены из различных тканевых источников и мо-
гут быть обусловлены стабильными комплексами гепарина с белками , а
также наличием примесей . По разным данным , молекулярный вес гепарина
составляет от 4800 до 20000 . Метод низкого угла рассеяния Х-лучей дает
значение молекулярного веса в 12900 , что хорошо согласуется с результата-
ми , полученными с помощью равновесной седиментации и внутренней вяз-
кости : 12500 и 12600 соответственно . Методом гельфильтрации на сефа-
дексе G-200 показано, что молекулярные веса гепарина , полученного из
мукозы собаки и быка , а также из легких быка , равны 11000 - 12000 .
Как известно в ряду моносахарид ( олигосахарид ( полисахарид ИК-
- спектры поглощения упрощаются в связи с перекрыванием многих полос .
И хотя в настоящее время интерпретация ИК-спектров ВМС подобной слож-
ной структуры крайне затруднена и точный метод анализа еще не разработан,
полученный А.М.Ульяновым и др. ИК-спектр гепарина фирмы “СПОФА” (ЧССР)
позволил идентифицировать наличие максимумов поглощения , соответствую-
щих валентным колебаниям следующих групп : SO(N ,SO3 ,COO-, а также груп-
пировки С—С , ОН - и ряд других , присущих структуре молекулы гепарина .
В спектре поглощения гепарина в УФ-области области слабый максимум при
267 нм . возможно это обусловлено незначительными примесями белка или
аминокислот . Так , А.Ф.Алекперов (1972) пришел к выводу , что чистые
образцы гепарина не дают полос поглощения в УФ-области спектра . Однако
при исследовании водных растворов ряда коммерческих препаратов гепарина
удалось выявить максимум поглощения при 258 нм . Автор отмечает ,что ука-
занную полосу поглощения дает фенилаланин . С помощью фотометрии и
хроматографии на бумаге показано , что в препаратах гепарина в небольших
количествах присутствует белок : минимум в гепарине фирм “ПОЛЬФА” и
“РИХТЕР” (0,0026 и 0,0035 г) и максимум в гепарине фирмы “СПОФА “ и Бакин-
ского завода (0,0045 и 0,006 г ). Алекперов отмечает ,что полученные данные
могут служить критерием чистоты этих препаратов .
Седиментационный анализ гепарина дал коэффициент седиментации для
1% - ного водного раствора фирмы “СПОФА” 2,65 S.
Описаны различия в биологической активности между L- и (- гепаринами .
Это обусловлено тем , что у L-гепарина глюкозамин присоединен L-гликозид-
ной связью , (-гепарин имеет в своем составе галактозамин , соединенный
(-гликозидной связью . (-гепарин , имеющий в своем составе более низкое
содержание серы и меньший молекулярный вес ,чем L- гепарин , обладает
и меньшей биологической активностью . По химической структуре он предста-
вляет собой хондроитинсерную кислоту с ацилированной аминогруппой и со-
держит галактозамин вместо глюкозамина .
ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ ГЕПАРИНА И
ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Понятие биологической активности гепарина весьма широко , так как спектр
его физиологического действия очень велик . Сюда можно отнести анти
-коагулянтную активность , антилипемическое , антимитотическое влияния,
регуляторное воздействие в отношении ряда ферментативных систем и т.д.
Однако наиболее изученным и имеющим большое практическое применение
является антикоагулянтный эффект гепарина . Поэтому говоря о биологическом
действии гепарина, в основном говорят о его антикоагулянт-
ных свойствах .
Обнаружено , что антикоагулянтная активность гепарина связана с
особенностями строения его молекулы . Так ( антикоагулянтная активность
зависит от содержания серы ( степени сульфатированния ( количества
и расположения О - сульфатных групп ( а также от размера скелета молекулы
этого полисахарида . Активность выше в препаратах с большим содержанием
эфиросвязанной серы . С.В. Бычков и В.Н. Харламова (1975) показали ( что
активность фракции ( в которой на дисахаридную структурную единицу прихо-
дится четыре остатка серной кислоты ( в 1,4 раза превышает активность фра-
кции гепарина с тремя остатками . Таким образом ( антикоагулянтные актив
-ность гепарина растет по мере увеличения содержания в молекуле остат-
ков серной кислоты. Видимо( данная активность зависит от положения остатков
серной кислоты в молекуле гепарина ( а также от длины цепи моле кулы . В
экспериментах с плазмой крови кроликов получено ( что максималь-
ная антикоагулянтная активность гепарина проявляется при рН плазмы
7,3—7,5 ( а минимальная при рН 6,1—6,5.
Высказано утверждение ( что биологическая активность гепарина опреде-
ляется степенью сульфатации ( карбоксилации ( а также размером ( формой
молекулы и молекулярным весом . В частности ( показано ( что
десульфирование ( происходящее в результате мягкого гидролиза ( сопро-
вождается уменьшением биологической активности . При сильной щелочной
реакции среды гепарин разрушается ( что выражается в быстрой потере им
в первую очередь антилипемической активности . С другой стороны ( даже
низкая кислотность вызывает потерю гепарином антикоагулянтной активности.
Причем степень этой потери прямо пропорциональна степени появления в
молекуле гепарина свободных аминогрупп . Полная инактивация происходит
когда более половины азота присутствуют в форме свободных NH2 - групп .
Под действием горячей уксусной кислоты гепарин теряет значительную часть
антикоагулянтной активности при одновременном сохранении молекулярного
веса и содержания глюкозамина . При этом наблюдается увеличение кон-
станты седиментации и степени полидисперсности параллельно с умень-
шением фрикционного соотношения . Предполагается ( что аминный азот (
который первым отщепляется в процессе рекристаллизации гепарина после
его обработки кислотой ( играет важную роль в проявлении
антикоагулянтной
активности . При рН среды 1—2 и 25( в течение 25 часов изменения биоло-
гической активности гепарина не происходит . Изменение активности наб-
людается после воздействия в течение 60 часов рН 4,4 и 23( . Видимо
под влиянием кислоты в молекуле гепарина образуются внутренние эфиры
( что объясняет наблюдаемые изменения молекулярного веса ( внутренней
вязкости и состава молекулы .
Многочасовое воздействие на бычий (- и (- гепарин 40%-ной
уксусной
кислотой при 37( сопровождалось потерей этими веществами 7—8% суль-
фатных групп и почти 100% антикоагулянтных свойств .
Гепарин не изменяет своих нативных свойств ( в частности
антикоагу-
лянтной активности ( в процессе обработки его паром при 100( в
течение
часа при рН 7 . Следовательно ( гепарин можно стерилизовать .
Отмечена корреляция между антикоагулянтной активностью фракций
гепарина и его молекулярным весом . Так даже при незначительном
уров- не сульфата (2,0 — 2,8 сульфатных групп на остаток глюкозы) у
препара-
тов гепарина с низким молекулярным весом (степень полимеризации равна
9) отмечалась слабая активность . Интересно ( что сульфатированные дек-
страны с высоким молекулярным весом также проявляют весьма высокую
антикоагулянтную активность . Активность низкомолекулярных фракций гепа-
рина мала . Антикоагулянтная активность гепарина с молекулярным весом
от 2500 до 15500 увеличивается по мере возрастания молекулярного
веса
до 10000 ( но дальнейшее возрастание не вызывает заметных сдвигов .
Уменьшение молекулярного веса гепарина при гидролизе в большей мере
обусловлено степенью десульфатации молекулы ( чем ее деполимеризации.
При частичном гидролизе отмечено также падение молекулярного
веса
и соотношения осей молекулы гепарина ( а также снижение вязкости в
воде . С помощью дисперсии оптического вращения показано ( что N -
- десульфатация гепарина не изменяет его естественной структуры ( но
полная десульфатация вызывает исчезновение нативной конформации .
(-облучение вызывало деполимеризацию гепарина ( но десульфатация при
этом не наблюдалась . Воздействие УФ - излучения снижало антикоагулян-
тную активность и уменьшало потенциальную возможность связывания их
катионных красителей . Поток же электронов обусловливал деполиремиза-
цию гепарина .
Действие гепарина ( ингибитора практически всех фаз процесса
сверты-
вания крови ( проявляется при наличии и участии кофактора гепарина (
присутствующего в плазме крови . Кофактор гепарина ( возможно (
предста- вляет собой одну из фракций сывороточного альбумина .
Прежде всего необходимо подчеркнуть ( что в настоящий момент нет
пол-
ной ясности относительно механизмов биосинтеза гепарина . Исходные
вещества необходимые организму для образования гепарина ( - глюкоза и
неорганический фосфат . Сульфатация происходит в тучных клетках
сразуже вслед за полимеризацией . Напротив ( Райс и соавторы (Rice et
al.(1967)
считают ( что перенос сульфата происходит на низкомолекулярные пред-
шественники . Предполагают также ( что способность управлять переходом
сульфата в N - десульфированный гепарин проявляет микросомальная
фракция из гомогената мастоцитов опухоли и что свободные
аминогруппы
необходимы для энзиматической N - сульфатации гликозаминогликанов
На основании экспериментов ( проводимых на ткани мастоцитомы
мы - ши ( по изучению биосинтеза специфического остатка глюкуроновой
кис- лоты была предложена схема реакций биосинтеза в области связи
ге-
парин - полипептид . Высказано предположение ( что в процессе синтеза
происходит ряд специфических гликозилтрансферазных реакций . При этом
продукт каждого предыдущего этапа служит субстратом для следующей
реакции . Для каждой реакции переноса необходим отдельный фермент .
наличие одного из таких ферментов - глюкуронозилтрансферазы обнаруже-
но в мембране тучных клеток .
Вопрос о точной локализации структур ( связанных с биосинтезом
гепарина ( до сих пор не решен . Однако есть многочисленные указания
на то ( что непосредственное отношение к синтезу имеют тучные
клетки
соединительной ткани ( а также генетически родственные и функциональ-
но близкие им базофильные клетки крови ( в связи с чем и те и
другие
получили название “гепариноциты”. Доказано ( что содержащие гепарин
гранулы тучных клеток выделяют это вещество в межклетники и кровь
.
Также базофилы служат источником гепарина ( выделяя в плазму крови
небольшие порции этого антикоагулянта . Но отмечая несоответствие
между общим количеством гепарина в организме и его содержанием в
тучных клетках ( предполагает возможность существования и других
источ-
ников гепарина .
Известно ( что тучные клетки ( имеющиеся в организме не только
выс-
ших животных ( но и морских звезд ( моллюсков ( ракообразных и
представляющие собой обязательную часть соединительной ткани ( разви-
ваются из тканей мезенхимы . Предшественниками тучных клеток являют-
ся ( очевидно ( промакрофоги моноцитарного происхождения . Вероятно ( кле-
точные элементы крови моноцитарного ряда ( проникая в межклетники сое-
динительной ткани ( дают начало тучным клеткам . Как считается (
молодые
тучные клетки берут свое происхождение от клеток ( подобных средним
лимфоцитам . последние также активно синтезируют гепарин и другие
су-
льфатированные мукополисахариды .
Основанием для утверждения о непосредственном отношении тучных клеток
к процессу свертывания крови послужило их расположение вблизи
кровеносных сосудов ( а также то ( что они являются носителями
гепарина.
До 90% всей массы тучных клеток приходится на заполняющие цитоплаз-
му базофильные метахроматические гранулы диаметром 0(3 - 1(0 мк . На
1 мг тучных клеток крысы приходится 316 международных единиц гепарина(
который весьма прочно связан с гранулами ( так что его можно
выделить
лишь после их разрушения . Наряду с этим имеются указания на то (
что
гепарин находится в цитоплазме в свободном состоянии .
В пользу того ( что гепарин синтезируется в тучных клетках (
говорит факт обнаружения в них ряда ферментов ( обеспечиваюших
образование
сульфатированных мукополисахаридов . Весьма важным доказательством
служит и то ( что меченые предшественники включаются в гепарин
гранул
тучных клеток ( сам же предварительно меченый гепарин в них не
обна-
руживается . Кроме гепарина в гранулах тучных клеток разных видов
мле-
копитающих содержатся нейтральные мукополисахариды ( гепарин - моно-
сульфат . Основу гранул представляет комплекс белок - гепарин .
Гепарин
существует преимущественно в жесткой валентной комбинации с белками
и практически не обнаруживается в заметных количествах как
экстрацел-
лулярный компонент соединительной ткани . Прочная связь гепарина и бел-
ка при этом обусловлена соединением сульфатных и карбоксильных
групп
полисахарида с NH-группами аргинина белка . Менее прочно с этим ком-
плексом посредством свободных СОО - групп белка связан гистамин.
Относительно происхождения гранул тучных клеток существует и
такая
точка зрения ( согласно которой они являются производными аппарата Го-
льджи . С другой стороны считается ( что они представляют собой специ-
фические структуры ( дифференцировавшиеся из митохондрий .
Гепарин содержится во всех тканях млекопитающих ( имеющих
клеточные элементы : в печени ( легких ( селезенке ( в стенках
кровеносных
сосудов ( в пищеварительном тракте ( коже и др. Есть он и в муцине
сви-
ньи ( в крови ( печени и мышцах рыб ( в тканях ряда морских
моллюсков .
Наиболее богаты гепарином легкие и печень млекопитающих . Гепарин
обнаружен также в потовой жидкости . Важнейшим источником для полу-
чения гепарина в фармакологических целях является ткань легких и
капсу-
ла печени быка . Гепарин обнаружен в эритроцитах и лейкоцитах .
Около
90% гепарина крови связано с форменными элементами . Известно большое
количество других источников гепарина и гепариноподобных веществ .
Так
ткани многих морских животных содержат вешества с высокой антикоагу-
лянтной активностью . Гепарин также выделен из кожи крыс. Показано (
что выделенное вещество представляет собой высокомолекулярное сое-
динение с разветвленной структурой ( а не агрегат низкомолекулярных .
Его молекулярный вес 1100000 ( а коэффициент седиментации 12(8 S .
Препарат гепарина в 16 раз более вязок ( чем гепарин из муцина
свиньи
Китовый гепарин ((-гепарин) впервые был выделен из легких и
кишечника
кита - полосатика . Отличительная особенность его структуры заключается
в том ( что он содержит N - ацетилглюкозамин ( к которому
присоединены другие группы гепарина . Молекулярный вес ( - гепарина
близок к весу гепарина полученного из тканей крупного рогатого
скота .
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕПАРИНА
Препараты ( пути введения ( разрушения . Получают гепарин из легких
крупного рогатого скота . Для медицинского применения выпускается в
виде натриевой соли - аморфного белого порошка ( рас-
творимого в воде и изотоническом растворе натрия хлорида ; рН 1%
раствора 6(0 - 7(5 .
Активность гепарина определяется биологическим методом -
- по способности задерживать свертывание крови и выражается в
единицах действия ( ЕД ) ; 1 мг международного стандарта гепарина
содержит 130 ЕД ( 1 ЕД = 0(0077 мг ). Практически препарат выпус-
кается с активностью не менее 110 ЕД в 1 мг . Для инъекций выпус-
кается раствор гепарина по 5000 ( 10000 и 20000 ЕД в 1 мл .
За рубежом выпускается также йодогепаринат натрия ( гепари -
нат ( другие препараты гепарина пролонгированного действия .
Вводится гепарин внутривенно ( внутримышечно ( подкожно ( в ви-
де аэрозоля ингаляционно ( субвагинально .
В настоящее время получены гепариноподобные соединения (
так называемые гепариноиды . К этой группе относится отечествен -
ный препарат синантрин - С ( полученный из целлюлозы . Он удержи-
вается в крови дольше ( чем гепарин ( поэтому его вводят в меньших
дозах . Выпускается в ампулах по 5 мл (3200 ЕД) . Вводят препарат в
острых случаях внутривенно и внутримышечно по 2 мл через каждые
6 ч. ( а в тяжелых случаях - по 4 мл каждые 4 ч. Длительность приме-
нения такая же ( как гепарина.
За рубежом испытан с благоприятным эффектом в эксперименте
и клинике гепариноид G 31150 . К гепариноидам относятся кроме того(
ликвемин ( ликвоид ( декстрасульфат ( атероид ( гемоклар ( декстранин(
перитол ( требурон ( тромбостоп ( элепарон и др.
Однако большинство указанных препаратов все еще изучаются и
пока не получили более или менее широкого распространения в кли-
нической практике ( где по прежнему предпочтение отдается гепарину.
Гепарин входит в состав тромболитина ( содержащего трипсин и
гепарин в соотношении 6 :1 . Препарат обладает фибринолитическими
и антикоагулянтными свойствами ( выпускается во флаконах по 0(05
и 0(1 г. Пименяют внутривенно и внутримышечно . Для внутривенного
введения содержимое флакона растворяют в 20 мл изотонического
раствора хлорида натрия ( для внутримышечных инъекций - в 5 -10 мл 0(5 - 2%
раствора новокаина . Внутривенно вводят медленно ( в течение 3 - 5 мин)
. Для субвагинального применения выпускаются препараты отечественного
производства валогеп и румынского производства —
— гепарин-1.
Наружно применяют мазь гепариновую следующего состава : гепа-
рина 2500 ЕД ( анестезина 1 г. ( бензилового эфира никотиновой кис-
лоты 0(02 г. ( мазевой основы до 25 г.
Наиболее постоянное общее действие гепарина как антикоагулянта
наблюдается при внутривенном введении . При этом эффект наступа-
ет уже через 3 - 5 .
Основным методом введения гепарина в клинике в настоящее время
является парентеральный .
Введенный в организм гепарин частично разрушается в печени и
почках ( частично выделяется в неизмененном виде с мочой .
Период полураспада гепарина зависит от дозы введенного препа-
рата : после инъекции 3000 ЕД он составляет 40 минут и после инъ-
екции 10000 ЕД 69 - 83 мин.
Роль гепарина в
гормональной
регуляции функций
фармакологические
|
